Moleküler Genetik

Moleküler genetik departmanı klinik amaçlarla kalıtsal bir hastalığa yol açan mutasyon ve/veya genotiplerin belirlenmesine yönelik çalışmalar yapmaktadır. Hastalığa neden olan mutasyonların saptanmasının yanında bir genetik hastalığın taşıyıcılık analizi ve multifaktöriyel hastalıklara yatkınlık analizi de çalışılmaktadır. Tek gen hastalıkları (Talasemi, FMF), Multifaktöriyel Hastalıklar (Kanser), Mitokondriyal Hastalıklar (LHON) moleküler genetik departmanında çalışılmaktadır.

Rutin genetik analizlerde merkezimizde kullanılan bazı teknikler aşağıda sıralanmıştır.

• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
• PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Sequencing (Dizi analizi)
• RT-PCR (Real Time PCR)
• Heterodubleks analizi

RFLP

Restriksiyon endonükleazlarla (DNA’yı belirli bölgelerinden kesen enzimler) DNA’nın farklı büyüklüklerdeki fragmanlara ayrılarak incelenmesine dayanmaktadır. Genotipleme ve polimorfizm çalışmalarında yaygın şekilde kullanılmaktadır.

PCR

Belirli bir DNA bölgesinin primer olarak adlandırılan bir başlatıcı yardımıyla enzimatik olarak çoğaltılmasıdır. Belli bir DNA parçasının milyonlarca kopyasının çıkartılmasını sağlamaktadır.

• Denatürasyon: İlk aşamada DNA molekülünün çift zincirli yapısı yüksek ısı yardımıyla birbirinden ayrılır. Çoğunlukla 94-97°C arasında 15-60 sn süresince uygulanır.
• Annealing (Bağlanma): Denatürasyonu takiben daha düşük ısılarda oligonükleotid primerler, ayrılmış olan tek zincirli DNA üzerinde kendi eşlenikleri olan bölgelere bağlanırlar. Bu olay çoğunlukla 47-60°C arasında 30-60 sn’de gerçekleşir; G/C oranı yüksek bölgelerde bağlanma ısısı 68°C’ye kadar çıkabilir.
• Elongasyon (Uzama): Son aşamada ısı 72°C’ye kadar arttırılarak DNA polimeraz enziminin tamamlayıcı DNA zincirini uzatması sağlanır. Süre, kullanılan polimeraza ve çoğaltılacak DNA parçasının uzunluğuna göre yaklaşık 30 saniye ile 3 dakika arasında değişebilir.

Sekans Analizi

Dizisi bilinmeyen bir DNA bölgesindeki nükleotitlerin diziliminin belirlenmesi işlemidir. Genlerde meydana gelen bazı nükleotit değişimleri mutasyon olarak adlandırılır ve çeşitli kalıtsal hastalıklara neden olur. Hastalığa sebep olan gen bölgesi Sekans Analizi tekniği ile taranarak mutasyonun gen üzerindeki yeri tespit edilir. Sekans analiz cihazlarının gelişmesiyle işlem süresi kısalmıştır. Beta Talasemi ve FMF gibi birçok tek gen hastalığında kesin tanıya yönelik değerlendirmelerde dizileme yöntemleri kullanılmaktadır.

Real Time-PCR

Real-time PCR, reaksiyon esnasında her bir PCR döngüsünde yeterli miktarda ürünün verdiği floresans ışığa göre çalışıp reaksiyonu aşama aşama kontrol eden bir sistemdir. PCR ürünlerinin miktarını eş zamanlı ölçebilir. Enfeksiyon testlerinde ve hematolojide çokça kullanılmaktadır.

Heterodupleks Analizi

Heterodupleks analizi, referans DNA (normal DNA) ile mutasyon içeren DNA arasındaki dizi farklılıklarını belirleyen bir yöntemdir. Referans ve test edilen DNA karıştırılır, ısı kullanılarak denatüre edilir ve soğutularak DNA’ların hibrid oluşturması sağlanır. İki DNA dizisinde farklılık varsa aynı noktada iki baz eşleşemeyecek ve heterodupleks bir form oluşacaktır. Heterodupleksler elektroforezde homoduplekslere göre daha yavaş hareket edeceğinden kolayca ayırt edilebilirler.