Молекулярная Генетика

Отдел молекулярной генетики проводит исследования, направленные на выявление мутаций и/или генотипов, вызывающих наследственное заболевание, в клинических целях. Помимо выявления мутаций, вызывающих заболевание, здесь также проводится анализ носительства генетического заболевания и анализ предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям. В отделе молекулярной генетики исследуются моногенные заболевания (талассемия, СПЛ), мультифакториальные заболевания (рак), митохондриальные заболевания (LHON).

Ниже перечислены некоторые методы, используемые в нашем центре при рутинных генетических анализах.

• ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов)
• ПЦР (полимеразная цепная реакция)
• Секвенирование (анализ последовательности)
• ПЦР в реальном времени (Real Time PCR)
• Гетеродуплексный анализ

ПДРФ

Метод основан на разделении ДНК на фрагменты различного размера с помощью рестрикционных эндонуклеаз (ферментов, разрезающих ДНК в определённых участках). Широко применяется в исследованиях генотипирования и полиморфизма.

ПЦР

Ферментативное копирование определённого участка ДНК с помощью инициирующей молекулы, называемой праймером. Позволяет получить миллионы копий определённого фрагмента ДНК.

• Денатурация: на первом этапе двухцепочечная структура молекулы ДНК разделяется под воздействием высокой температуры. Обычно проводится при 94–97°C в течение 15–60 секунд.
• Отжиг (связывание): после денатурации при более низкой температуре олигонуклеотидные праймеры связываются с комплементарными им участками на разделённых одноцепочечных молекулах ДНК. Обычно этот процесс происходит при температуре 47–60°C в течение 30–60 секунд; в областях с высоким содержанием G/C температура отжига может достигать 68°C.
• Элонгация (удлинение): на заключительном этапе температура повышается до 72°C, что позволяет ферменту ДНК-полимеразе удлинять комплементарную цепь ДНК. Продолжительность этого этапа, в зависимости от используемой полимеразы и длины копируемого фрагмента ДНК, может составлять от примерно 30 секунд до 3 минут.

Анализ последовательности (секвенирование)

Определение последовательности нуклеотидов на неизвестном участке ДНК. Некоторые изменения нуклеотидов, происходящие в генах, называются мутациями и приводят к различным наследственным заболеваниям. Область гена, вызывающая заболевание, сканируется методом секвенирования для определения местоположения мутации в гене. С развитием секвенирующих приборов время проведения анализа сократилось. Методы секвенирования используются для точной диагностики многих моногенных заболеваний, таких как бета-талассемия и СПЛ.

ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени — это система, которая работает по флуоресцентному сигналу, испускаемому достаточным количеством продукта в каждом цикле ПЦР во время реакции, и позволяет поэтапно контролировать реакцию. Она позволяет одновременно измерять количество продуктов ПЦР. Широко применяется в диагностике инфекций и в гематологии.

Гетеродуплексный анализ

Гетеродуплексный анализ — это метод выявления различий в последовательности между референсной (нормальной) ДНК и ДНК, содержащей мутацию. Референсная и исследуемая ДНК смешиваются, денатурируются под воздействием температуры и затем охлаждаются для образования гибридов ДНК. Если между двумя последовательностями ДНК есть различие, в соответствующей точке два основания не смогут образовать пару, и образуется гетеродуплексная форма. Гетеродуплексы движутся при электрофорезе медленнее, чем гомодуплексы, что позволяет легко их различить.