Genética Molecular

El departamento de genética molecular realiza estudios con fines clínicos orientados a determinar las mutaciones y/o genotipos causantes de una enfermedad hereditaria. Además de la detección de las mutaciones causantes de la enfermedad, también se realizan análisis de portación de enfermedades genéticas y análisis de predisposición a enfermedades multifactoriales. En el departamento de genética molecular se estudian enfermedades monogénicas (talasemia, FMF), enfermedades multifactoriales (cáncer) y enfermedades mitocondriales (LHON).

A continuación se enumeran algunas de las técnicas utilizadas en nuestro centro para los análisis genéticos rutinarios.

• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
• PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Secuenciación (análisis de secuencia)
• RT-PCR (Real Time PCR)
• Análisis de heterodúplex

RFLP

Se basa en el estudio del ADN separado en fragmentos de distintos tamaños mediante endonucleasas de restricción (enzimas que cortan el ADN en regiones específicas). Se utiliza ampliamente en estudios de genotipado y polimorfismo.

PCR

Es la amplificación enzimática de una región específica del ADN mediante un iniciador denominado cebador (primer). Permite obtener millones de copias de un fragmento de ADN determinado.

• Desnaturalización: En la primera etapa, la estructura bicatenaria de la molécula de ADN se separa mediante altas temperaturas. Generalmente se aplica entre 94 y 97 °C durante 15-60 segundos.
• Hibridación (Annealing): Tras la desnaturalización, a temperaturas más bajas, los cebadores oligonucleotídicos se unen a sus regiones complementarias en el ADN monocatenario separado. Este proceso suele producirse entre 47 y 60 °C durante 30-60 segundos; en regiones con un alto contenido de G/C, la temperatura de hibridación puede llegar hasta 68 °C.
• Elongación (Extensión): En la última etapa, la temperatura se eleva hasta 72 °C para que la enzima ADN polimerasa extienda la cadena de ADN complementaria. La duración puede variar entre aproximadamente 30 segundos y 3 minutos, según la polimerasa utilizada y la longitud del fragmento de ADN a amplificar.

Análisis de Secuencia

Es el procedimiento mediante el cual se determina el orden de los nucleótidos en una región de ADN de secuencia desconocida. Algunos cambios de nucleótidos que se producen en los genes se denominan mutaciones y causan diversas enfermedades hereditarias. Mediante la técnica de Análisis de Secuencia se estudia la región génica causante de la enfermedad para determinar la localización de la mutación en el gen. Con el desarrollo de los equipos de secuenciación, el tiempo de procesamiento se ha reducido. En numerosas enfermedades monogénicas, como la Talasemia Beta y la FMF, los métodos de secuenciación se utilizan en las evaluaciones dirigidas al diagnóstico definitivo.

Real Time-PCR

La PCR en tiempo real es un sistema que controla la reacción etapa por etapa, funcionando según la luz fluorescente emitida por una cantidad suficiente de producto en cada ciclo de PCR durante la reacción. Puede medir la cantidad de productos de PCR en tiempo real. Se utiliza ampliamente en pruebas de infección y en hematología.

Análisis de Heterodúplex

El análisis de heterodúplex es un método que determina las diferencias de secuencia entre el ADN de referencia (ADN normal) y el ADN que contiene una mutación. El ADN de referencia y el ADN a estudiar se mezclan, se desnaturalizan mediante calor y se enfrían para permitir que los ADN formen híbridos. Si existe una diferencia entre las dos secuencias de ADN, en ese punto las dos bases no podrán aparearse y se formará una estructura heterodúplex. Dado que en la electroforesis los heterodúplex se desplazan más lentamente que los homodúplex, pueden distinguirse con facilidad.